小球藻接种前，所用的液体培养基和容器于1.2 kg·cm-2压力下蒸汽灭菌20min。从保存藻种的平板上挑取小球藻，培养于装有5 mL BBMG液体培养基的试管中。弱光下培养5-7 d，再将试管种接入50 mLBBMG 液体培养基，于弱光下培养至对数期，此为最初的液体种子。培养小球藻时，接入2% 的液体种子于50 mL 培养液中，放在摇床上于25℃弱光下培养，摇床转速为120 r·min-1，4-5 d 即可得到实验用的小球藻。
③、预处理液的加入
在室温下分别取2 mL藻液置于若干离心管中离心(转速500 r·min-1，下同)，弃去上清液，小球藻沉降于离心管底部，然后分别加入预先配制的预处理液（预处理液为0.5 mol·L-1甘油和0.4 mol·L-1 蔗糖的组合），混匀，于室温下处理20 min 后再离心。
④、玻璃化液处理
玻璃化液配方为30% 蔗糖+15％乙二醇+ 10%二甲基亚砜+ BBMG 培养液，加入前先放在0-4℃下预冷，在无菌条件下取代预处理液，悬浮后移入冻存管，于0 ℃下预冻60 min后放入液氮中保存。
⑤、化冻和玻璃化保护剂的去除
将在液氮中保存的冻存管取出，立刻放入40℃恒温水浴中迅速摇动，直到最后一个冰晶消失后移入室温中。化冻后的小球藻在无菌条件下先在0.4 mol·L-1的蔗糖溶液中室温平衡5 min，然后再在1.2 mol·L-1蔗糖溶液中平衡5 min，最后转入BBMG 液体培养基中培养。培养条件为27℃、弱光、摇床速度120 r·min-1，培养4 d。
㈡、固定化保存法
①、固定化胶球的制备
将2.5ml注射器，4%的海藻酸钠（溶解液）与培养至对数生长期的藻种液按一定的比例(可以用同等比例）混合均匀，将混合液滴入盛有0.1mol/L氯化钙溶液的三角烧瓶中。边滴边摇动。静止15分钟后。将形成海藻酸钙——细胞固定化胶球。
②、保存
将上述胶球用铝箔纸包裹密封在三角烧瓶内。不添加任何培养液，保存在黑暗中，置于4°C的冰箱中保存。最长可保存一年。
③、测再生能力
保存15天后，取胶球，用无菌去离子水清洗三次。移入150ml三角烧瓶内,并加入50ml培养液培养.往胶球中加入一定体积的0.1mol/L的柠檬酸钠溶液溶解胶球。测再生能力。
8．存活率的测定
将经过处理的小球藻样品和对照小球藻样品再培养4 d 后，用722 型光栅分光光度计于波长540 nm 处测藻液的吸光度。根据预先确定的藻细胞密度(y×108个·L-1)和吸光度(x)的直线回归方程：y=3.456x-0.389(r=0.9961)，可以推算出上述冰冻样品和对照样品在再培养4 d 后的藻细胞密度，两者的百分比值即为超低温保存的存活率。实验重复3 次，每处理设置3 个平行样品，取平均值。
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